色谱法的意义_

  高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高等优点,其应用场景范围之广,是其它分析仪器所不能够比拟的。随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化,本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。《中国药典》(2005 年版)一部应用高效液相色谱法测定含量的中药品种达479 种,涉及518 项,其中药材就有98 种。

  (3) 展开将点好供试品的薄层板放入展开缸中,浸入展开剂的深度为距原点5mm 为宜,密闭。除另有规定外,一般上行展开8 ~15cm ,高效薄层板上行展开 5 ~8cm 。溶剂前沿达到规定的展距,取出薄层板,晾干,待检测。

  展开前如需要溶剂蒸气预平衡,可在展开缸中加入适量的展开剂,密闭,一般保持15 ~30 分钟。溶剂蒸气预平衡后,应迅速放入载有供试品的薄层板,立即密闭,展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态,则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸,密闭一段时间,使达到饱和再如法展开。必要时,可进行二次展开或双向展开。

  (2) 限度检查采用与定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较,颜色( 或荧光) 不得更深;或照薄层色谱扫描法操作,峰面积值小于对照品的峰面积值。

  (1) 薄层板有市售薄层板(普通或高效板)和自制薄层板,可根据自身的需求选用。

  (2) 点样通常在洁净干燥的环境,用专用毛细管或配合相应的半自动或自动点样器械将样品点样于薄层板上,一般为圆点状或窄细的条带状,点样基线mm ,高效板一般基线mm 。圆点状直径一般不大于3mm ,高效板一般不大于2mm ;接触点样时注意勿损伤薄层板表面。条带状宽度一般为 5 ~l0mm 。高效板条带宽度一般为 4 ~8mm ,可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜,一般不少于8mm ,高效板供试品间隔不少于5mm 。

  常用色谱法又可根据分离方法分为:薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等。采用薄层色谱法分离有色物质时,可根据其色带进行区分;分离无色物质时,可在短波(254nm) 或长波(365n m) 紫外光灯下检视,也可喷以显色剂使之显色,或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶,采用荧光猝灭法检视。气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。

  (2) 分离度用于鉴别时,对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点,应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时,要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度,分离度(R) 的计算公式为:

  式中, d 2 为相邻两峰中后一峰与原点的距离; d 1 为相邻两峰中前一峰与原点的距离;W 1 及W 2 为相邻两峰各自的峰宽。通常分离度应大于 1.0 。

  紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一些范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系,必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。

  不同的检测器,对流动相的要求不同。如采用紫外检测器,所用流动相应至少符合紫外- 可见分光光度法对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。

  高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入柱内,各成分在柱内被分离,并依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

  (1) 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和别的类型的硅烷键合硅胶( 如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等) 也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱;凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等;手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。

  (2) 分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为:

  3) 重复性取对照品溶液,连续进样 5 次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0 %。也可配制相当于80 %、100 %和120 %的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成 3 种不同浓度的溶液,分别至少进样 2 次,计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于 2.0 %。

  (3) 流动相可采用固定比例( 等度洗脱) 或按规定程序改变比例( 梯度洗脱) 的溶剂组成作为流动相系统。由于C- 18 链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动相中有机溶剂的比例通常应不低于 5 %,否则 C 18 链的随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳定。

  由于现代色谱分析技术具有分离和分析两种功能,即能排除复杂组分间的相互干扰,逐个将组分进行定性和定量分析,因此,现代色谱分析技术很适合成分复杂的生药的有效性评价。

  色谱法根据其分离原理可分为:吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同,用溶剂或气体洗脱使组分分离;常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离;其中一相被涂布或键合在固体载体上,称为固定相,另一相为液体或气体,称为流动相;常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离;常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂,流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法,是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离;常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。

  以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2 ~8 的流动相。当pH 大于8 时,载体硅胶会被溶解;当pH 小于 2 时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH 大于8 的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机- 无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH 小于 2 的流动相时,应选用耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机- 无机杂化填充剂等。这些特殊的色谱柱已有商品供应。

  紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与待测溶液的浓度有关,还与化合物的结构有关。示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器,对所有的化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物,其响应值几乎仅与待测物的质量有关。二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱,故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。

  (5) 记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄,以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。

  用供试品和对照品对实验条件做试验和调整,使检测灵敏度、分离度和重复性符合要求。

  (1) 检测灵敏度用于限量检查时,采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下,于同一薄层板上点样、展开、检视,后者应显清晰的斑点。

  (4) 显色与检视供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视,也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色或加热显色,在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm 紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色,但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板( 如硅胶GF 254 板) ,在254nm 紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。

  填充剂的性能( 如载体的形状、粒径、孔径、比表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等) 以及色谱柱的填充,直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm(1nm=l0?) 以下的填充剂适合于分析分子量小于2000 的化合物,分子量大于 2 000 的化合物则应选择孔径在30nm 以上的填充剂。

  (3) 重复性同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 3.0 %;需显色后测定的相对标准偏差应不大于 5.0 %。

  (1) 鉴别取适宜浓度的对照品溶液与供试品溶液,在同一薄层板上点样、展开与检视,供试品溶液所显主斑点的颜色( 或荧光) 和位置应与对照溶液的斑点一致。

  系指用一定波长的光照射在薄层板上,对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点,或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描,将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点,按照规定方式扫描测定,一般选择反射方式,采用吸收法或荧光法。通常含量测定应使用市售薄层板。

  扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描,应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长,供试品色谱中待测斑点的比移值(R f 值) 和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符,以保证测定结果的准确性。薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内,必要时可适当调整供试品溶液的点样量,供试品与对照品同板点样、展开、测定和计算。

  近年来随着各种色谱仪器自动化程度的提高,特别是各种联用技术的发展,使得用现代色谱分析技术进行生药有效性评价和质量控制慢慢的变快速、简便和灵敏。

  薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上,在展开容器内用展开剂展开,使供试品所含成分分离,所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比,并可用薄层扫描仪进行扫描,用于鉴别、检查或含量测定。《中国药典》(2005 年版) 一部薄层色谱法用于定性鉴别的达 1 523 项,用于含量测定的为45 项,其中有 4 种药材采用薄层扫描法定量。

  色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中,分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。

  (1) 色谱柱的理论板数(n) 在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或内标物质溶液,记录色谱图,பைடு நூலகம்出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间t R ( 以分钟或长度计,下同,但应取相同单位) 和半高峰宽(W h/2 ) ,按n=5.54(t R /W h/2 ) 2 计算色谱柱的理论板数。